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點擊次數(shù)：1242 發(fā)布時間：2016/4/20 16:10:12
今天下午，極威生物elisa技術(shù)老師陳老師為公司新入職員工進行了簡單了培訓(xùn) ，主要培訓(xùn)內(nèi)容如下：
一、ELISA實驗操作要點有哪些？
1、Elisa實驗標準操作要點：優(yōu)質(zhì)的試劑
實驗的基本條件是：優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA 檢測結(jié)果準確可靠的必要條件。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的來使用，本公司要求使用的純化水電導(dǎo)率小于1.5μs/cm。
2、 Elisa實驗操作要點之二：標本的采取
很多實驗，基本上大部分ELISA 實驗檢測的樣本均以血清為標本。血清標本可按常規(guī)方法采集（具體采集方法可以咨詢相關(guān)業(yè)務(wù)員），采集過程中，應(yīng)注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP 為標記的ELISA 測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。另外血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。
二、Elisa實驗操作前樣本的保存方法
一般說來，在一周內(nèi)測定的血清標本可放置于4℃，標本在冰箱中保存時間過長容易導(dǎo)致血清IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需－20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡。混濁或有沉淀的血清標本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當防腐劑。抗凝不完全的標本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。
三、Elisa實驗過程中注意的事項：加樣，保溫，洗板及注意事項
1、加樣：實驗過程中，加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。保溫工作
在建立ELISA 方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)
1-2 小時，產(chǎn)物的生成可達頂峰。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應(yīng)，邊上的值會偏高，建議為了客觀的判斷結(jié)果，將質(zhì)控放在非邊緣位置。
3、Elisa洗滌過程注意事項
ELISA實驗過程中，洗滌雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELSIA 主要就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來�？梢哉f在ELISA 操作中，洗滌是*主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴格按要求洗滌，不得馬虎。
4、Elisa洗滌液
洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
5、Elisa洗板時注意事項
洗板時注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋，應(yīng)按要求稀釋，所用的水電導(dǎo)率在1.5us/cm 之下，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解后配制。保證洗板浸泡時間為40 秒左右，孔內(nèi)液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。
Elisa實驗的顯色和比色
TMB 經(jīng)HRP 作用后，約40 分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2 小時后即可完全消退至無色。TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24 小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指專用于測讀ELISA 結(jié)果吸光度的光度計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準確性為±1%，重復(fù)性達0.5%。酶標儀不應(yīng)安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15~30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30 分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。
測讀A 值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm 波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，次在*適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不 移動ELISA 板的位置，*終測得的A 值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。
四、Elisa實驗本底及假陽性產(chǎn)生的原因分析
1. 基因工程(Genetic Engineering)抗原與合成肽抗原的區(qū)別
1.1 基因工程(Genetic Engineering)抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌(Escherichia coli)或酵母菌為表達系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點：
a.分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達到數(shù)百個氨基酸；而利用基因工程(Genetic Engineering)制備的抗原，分子量更大。
這次的培訓(xùn)給新員工帶來了很多的收獲，好幾個員工表示，之前很多客戶問的一些問題都無法回答上來，經(jīng)過這次的培訓(xùn)后，以后在跟客戶交談中，如果遇到以上的一些問題，可以立馬給客戶解答，能夠更好的，更專業(yè)的為客戶服務(wù)，自己也收獲了很多的知識！
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