人寨卡病毒抗體（Zika virus Ab）定性檢測試劑盒（ELISA）

點擊次數(shù)：18089 發(fā)布時間：2016/7/8 9:18:54

定性檢測血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清液中人寨卡病毒抗體（Zika virus Ab）的濃度。

使用試劑盒前，必須仔細閱讀本說明書。

僅供科研使用，不得用于臨床診斷。

簡介

寨卡病毒屬黃病毒科，黃病毒屬，單股正鏈RNA病毒，直徑20nm，是一種通過蚊蟲進行傳播的蟲媒病毒，宿主不明確，主要在野生靈長類動物和棲息在樹上的蚊子，如非洲伊蚊中循環(huán)。

該病毒*早于1947年偶然通過黃熱病監(jiān)測網(wǎng)絡在烏干達寨卡叢林的恒河猴中發(fā)現(xiàn)，隨后于1952年在烏干達和坦桑尼亞人群中發(fā)現(xiàn)。該病毒活動一直比較隱匿，僅在赤道周圍的非洲、美洲、亞洲和太平洋地區(qū)有寨卡病毒感染散發(fā)病例。*早一次暴發(fā)流行是2007年發(fā)生在西太平洋密克羅尼亞群島的雅鋪島，更大的一次流行于2013年-2014年發(fā)生在大洋洲的法屬波利尼西亞，感染了約32000人。

伊蚊還傳播黃病毒科中的另外三種病毒，包括登革熱病毒、基孔肯雅病毒和黃熱病毒，也主要在熱帶和亞熱帶地區(qū)流行。幾十年前，非洲的研究者注意到伊蚊傳播的寨卡病毒疫情莫名其妙地跟隨伊蚊傳播基孔肯雅病毒疫情之后。類似的規(guī)律開始于2013年，當基孔肯雅病毒從西到東傳播時，寨卡病毒緊跟而來。

寨卡病毒病的潛伏期（從接觸到出現(xiàn)癥狀的時間）尚不清楚，可能為數(shù)天。寨卡病毒感染者中，只有約20%會表現(xiàn)輕微癥狀，典型的癥狀包括急性起病的低熱、斑丘疹、關節(jié)疼痛（主要累及手、足小關節(jié)）、結膜炎，其他癥狀包括肌痛、頭痛、眼眶痛及無力。另外少見的癥狀包括腹痛、惡心、嘔吐、黏膜潰瘍和皮膚瘙癢。癥狀通常較溫和，持續(xù)不到一周，需要住院治療的嚴重病情并不常見。2013年和2015年分別在法屬波利尼西亞和巴西塞卡疫情期間，有報道稱寨卡病毒病可能會造成神經(jīng)和自身免疫系統(tǒng)并發(fā)癥。

2015年巴西的寨卡暴發(fā)流行中發(fā)現(xiàn)了很多小頭畸形的新生兒（出生的新生兒頭圍與匹配的相同性別和孕齡的孩子比，低于平均值超過了兩個標準差）。在2015年5月-2016年1月間，共報道4000例感染寨卡病毒的孕婦分娩了小頭畸形兒，與往年小頭畸形的比例相比，上升了20倍。35例小頭畸形新生兒的頭顱CT及頭顱超聲提示存在彌漫性腦組織鈣化，主要發(fā)生在側腦室旁，薄壁組織旁和丘腦區(qū)域、基底節(jié)區(qū)域。皮質和皮質下萎縮造成的腦室萎縮也能見到。小部分嬰兒出現(xiàn)關節(jié)攣縮，提示周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累。對寨卡疫情開展調查發(fā)現(xiàn)，越來越多的證據(jù)表明寨卡病毒與小頭癥之間存有關聯(lián)。然而，在解釋嬰兒小頭癥與寨卡病毒之間的關系之前仍需要做出更多調查。

實驗原理

本試劑盒采用雙位點夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。在預包被人寨卡病毒（Zika virus）抗原（固相抗原）的微孔酶標板中，加入人寨卡病毒抗體（Zika virus Ab）陰、陽性對照和待測樣本，再加入HRP標記的抗人免疫球蛋白（Anti Human Ig Ab）抗體（酶標抗體），經(jīng)過溫育與充分洗滌，去除未結合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-抗原-酶標抗體的夾心復合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，在終止液（2M 硫酸）作用下，*終轉化為黃色，在酶標儀上測定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測樣品中人寨卡病毒抗體（Zika virus Ab）的濃度正相關。

試劑盒限制性

1、僅供科研使用，不得用于臨床診斷。

2、在試劑盒標示的有效期內(nèi)使用，過期產(chǎn)品不得使用。

3、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。

4、使用試劑盒配套的樣品稀釋液。

5、如果樣本值高于標準品濃度值，請將樣本適當稀釋后，再重新測定。

6、待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結果，檢測前，請排出該因素。

7、通過其他方法得到的檢測結果，與本試劑盒測定結果不具有直接的可比性。

技術提示

1、混合蛋白溶液時，避免起泡。

2、加校準品與樣本時，每個校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應該懸臂加樣，避免交叉污染。

3、合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結果準確性的必要條件。

4、使用自動洗板機時，加入一個30秒浸泡的步驟，可以提高檢測精度。

5、底物溶液為無色液體，保存過程中變?yōu)樗{色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。

6、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍色底物產(chǎn)物，會瞬間變?yōu)辄S色。

7、實驗中，用剩的板條，應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

8、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說明書標明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作。

試劑盒組分與保存

未開封的試劑盒保存在2-8度，不得使用過期試劑盒。組分	數(shù)量	主要成分	開封后儲存
陰、陽性對照	0.35ml/管	－－	2-8℃1天
包被微孔板	96T	預包被固相抗原	2-8℃14天
HRP標記抗體	6mL	HRP標記的檢測抗體	2-8℃180天
底物液A	6mL	0.01%過氧化氫	2-8℃180天
底物液B	6mL	0.1%TMB	2-8℃180天
30×濃縮洗滌液	20mL	0.05%Tween20	2-8℃180天
說明書	1份	－－	－－
自封袋	1個	－－	－－
不干膠	2片	－－	－－

其他用品

1、酶標儀

2、精密移液器及一次性吸頭

3、蒸餾水

4、洗瓶或者自動洗板機

5、37℃水浴鍋或恒溫箱

6、500ml量筒

7、質控品

生物安全

1、檢測必須符合實驗室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳染物進行處置。

2、試劑盒的液體組分中，含有proclin-300防腐劑，可能引起皮膚過敏反應，避免吸入煙霧與皮膚接觸。

3、底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。

4、戴上防護手套，實驗完成后徹底洗手。

樣品的采集和儲存

以下只是列出樣品采集和保存的一般指南。所有樣本采集保存過程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。

1、細胞培養(yǎng)上清：4000rpm條件下離心20min，去除細胞顆粒和聚合物，上清液保存在-20℃以下，避免反復凍融。

2、血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清，保存在-20℃以下，避免反復凍融。

3、血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下，避免反復凍融。

樣本收集后，不是一次檢測完，請按一次用量分裝凍存，避免反復凍融，使用時在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。

試劑準備

1、使用前，所有的組分都要至少復溫30min，確保充分復溫到室溫。

2、濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會有結晶產(chǎn)生，這屬于正�，F(xiàn)象，水浴加熱使結晶完全溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:30稀釋，即1份的濃縮洗滌液，添加29份的蒸餾水。

3、底物：底物液A和B，在使用前，按1:1體積充分混合，混合后15分鐘內(nèi)使用。

操作程序

所有試劑和組分都先恢復到室溫，標準品、質控品和樣品，建議做復孔。

1、按前面說明書描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。

2、從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

3、設置陰陽性對照孔、樣本孔，陰陽性對照孔各加不同濃度的標準品50μL。

4、樣本孔加待測樣本50μL。

5、所有孔中加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL。

6、用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

7、揭開封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復5次。若使用自動洗板機，請按洗板機操作程序進行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高檢測的精度。洗板結束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應板。

8、將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。

9、所有孔加入終止液50μL，在酶標儀上讀取各孔吸光度（OD值）。

結果計算

1、試驗有效性：陽性對照孔OD值平均值≥1.00；

陰性對照孔OD值平均值≤0.2。

2、臨界值（Cut off）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

3、陰性判斷：樣品OD值＜臨界值（Cut off），樣品為陰性

4、陽性判斷：樣品OD值＞臨界值（Cut off），樣品為陽性

試劑盒性能指標

1、物理性能

試劑盒的各液體組分應澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應真空包裝，無破損漏氣。

2、精密度

批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內(nèi)精度評估。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%。

批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。批間變異系數(shù)CV%小于15%。

3、特異性

本試劑盒識別天然和重組人寨卡病毒抗體（Zika virus Ab），與結構類似物無交叉。

4、穩(wěn)定性

2℃-8℃保存，有效期6個月。

原創(chuàng)作者：上海極威生物科技有限公司

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