三聚氰胺快速檢測試劑盒使用說明書2022

點擊次數(shù)：16915 發(fā)布時間：2022/12/26 11:43:03

三聚氰胺快速檢測試劑盒使用說明書

【測定原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測牛奶和水產(chǎn)等樣本中的三聚氰胺，在微孔條上預(yù)包被上偶聯(lián)抗原，利用抗原與抗體的特異性免疫化學(xué)反應(yīng)的原理來進行，樣本中的三聚氰胺和微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗三聚氰胺抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣品中的三聚氰胺含量與樣品的吸光度值呈反比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出三聚氰胺含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】

規(guī) 格：96孔/盒

靈敏度： 1ppb

檢測時間： 45min

樣本檢測下限：

奶粉………………………………………………20 ppb

牛奶………………………………………………16 ppb

牛奶/奶粉（處理法二）……………………… 1 ppb

組織（雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟）……………………2 ppb

飼料 …………………………………………100 ppb

蛋類 …………………………………………20 ppb

血清 ………………………………………… 4 ppb

交叉反應(yīng)率

三聚氰胺 …………………………………………100%

三聚氰酸……………………………………………60%

三嗪 ……………………………………………< 1%

三嗪二銨…………………………………………< 1%

回收率

牛奶/奶粉 ……………………………………90±15%

組織 …………………………… 85±10%

飼料 …………………………… 85±10%

蛋類 …………………………… 80±10%

【試劑盒組成】

1、微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、標(biāo)準(zhǔn)液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、1ppb、3ppb、9ppb、27ppb、81ppb

3、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：×1瓶：（1ml/瓶） 1ppm

4、酶標(biāo)記物 7ml………………… 紅色帽

5、抗體工作液 7ml………………… 綠色帽

6、底物A液 7 ml………………… 棕色帽

7、底物B液 7 ml …………………黑色帽

8、終止液　7 ml …………………黃色帽

9、 20X濃縮洗滌液40 ml……………白色帽

10、 2X濃縮復(fù)溶液 50 ml ……………藍色帽

【所用儀器、試劑】

具備的儀器：微孔板、酶標(biāo)儀、勻質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道 20ul～200ul、100ul～1000ul

多道 250 ul

試劑：乙腈、氫氧化鈉、濃鹽酸、去離子水、正己烷、甲醇

【實驗前溶液配制】

配液1、將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶。
配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

配液3 1M HCl 溶液取8.6ml濃HCl加去離子水定容至100ml。

配液4 1M NaOH 溶液稱取4g NaOH加去離子水定容至100ml。

配液5 0.1M NaOH 溶液稱取0.4g NaOH加去離子水定容100ml。

配液6 乙腈-0.1M NaOH溶液84ml乙腈和16ml 0.1M NaOH混合均勻。

【樣本前處理步驟】

樣本處理前須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、豬、牛、羊、兔、魚、蝦等。

（b）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（c）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

樣本處理方法

（a）牛奶專用樣本處理方法：

1、取牛奶樣本600µl到2ml的離心管中，加入1ml乙腈，充分振蕩混勻；4000r/min以上離心5min；

2、取100µl上清液，再加入500µl復(fù)溶液(見配液1)，混勻；

3、取50µl用于分析。樣本稀釋倍數(shù):16倍

（b）奶粉；奶酪專用樣本處理方法：

1、稱取2.0±0.05g奶粉樣本至50ml離心管中，加入4ml甲醇，充分振蕩；

2、15℃4000r/min以上離心10min，取100µl上清液，再加入900µl復(fù)溶液(見配液1)，混勻；取50µl用于分析。樣本稀釋倍數(shù):20倍

（c）飼料樣品處理方法：

1、將飼料樣品研碎，稱2.0±0.05g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml去離子水均質(zhì)。

2、旋流1min，放振蕩器上振蕩2min15℃4000r/min以上離心15min，取出10ml上清液并用1M NaOH將pH值調(diào)至6-8。（注：因飼料樣品的不同，加入1M NaOH的量有所差異，根據(jù)情況調(diào)節(jié)，一般加入范圍是0.5ml—1ml之間）。

3、15℃，4000r/min以上離心15min，吸出上清液。（如果上清仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過濾）。

4、用稀釋后的復(fù)溶液10倍稀釋上清液（取100µl上清液加入900µl稀釋后的復(fù)溶液，并且混合均勻，混合30s）。

5、取50µl進行分析樣本稀釋倍數(shù):100倍

（d）牛奶/奶粉樣本處理方法（處理法二）：

1、取2ml奶樣或2g奶粉至離心管中；加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，15℃ 4000r/min以上離心10min，取4ml上清液在56℃條件下氮氣或空氣流吹至wan全干燥；

2、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；

3、取50µl用于分析。樣本稀釋倍數(shù)：1倍定量下限定為：2ppb

（e）組織（雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟）樣本處理方法：

1、取2.0±0.05g均勻組織樣本于50ml離心管中；加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，15℃ 4000r/min以上離心10min，取2ml上清液在56℃條件下氮氣或空氣流吹至wan全干燥；

2、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；

3、取50µl用于分析。樣本稀釋倍數(shù)：2 倍

（f）蛋類樣本處理方法：

1、用均質(zhì)器低速均勻樣本（蛋清、蛋黃或全蛋）稱取2.0±0.05g均質(zhì)過的樣本，加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min；（注：蛋清含蛋白成份高，加入提取液后會形成一團膠狀物，較蛋黃或全蛋難易搖勻，此情況為正�，F(xiàn)象不影響實驗結(jié)果）15℃， 4000r/min以上離心10min，取1ml上清液在56℃條件下氮氣或空氣流吹至wan全干燥；

2、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；

3、取下層相用稀釋好的復(fù)溶液按1：3 （50µl樣本液加150µl稀釋后的復(fù)溶液）稀釋，混合30s；

4、取50µl用于分析。樣本稀釋倍數(shù)：20倍

（g）血清樣本處理方法：

1、取0.5ml血清樣本于50ml離心管中；

2、加入2ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，15℃ 4000r/min以上離心10min，取1ml上清液在56℃條件下氮氣或空氣流吹至wan全干燥；

3、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；

4、取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：4 倍

【酶標(biāo)免疫分析程序】

操作步驟：

1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、、按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

4、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /孔，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。

5、取出用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）

6、顯色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。

7、測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值（OD值）。

【結(jié)果判定】

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與三聚氰胺的含量成負相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 1ppb為1.816；3ppb為1.415；9ppb為0.74；27ppb為0.313；81ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是27ppb-81ppb; 樣本2的濃度范圍是3ppb-9ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中三聚氰胺實際濃度。

2、定量判定：

所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第yi個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

百分吸光度值（%）＝	B	×100%
	B₀

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中三聚氰胺實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。

3、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線：

4、再現(xiàn)性：

由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出三聚氰胺檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)三聚氰胺濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項】

1、使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

3、混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、不用的微孔板放進自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒zui佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。

原創(chuàng)作者：上海極威生物科技有限公司

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